L’indaco è un noto pigmento alcaloide, di largo impiego nell’industria tessile per la colorazione di cotoni e lane. È il comune colorante del denim, il tessuto dei blue jeans, e la sua tonalità (tra il blu e il violetto) è dovuta alla delocalizzazione degli elettroni pi-greco nella molecola. La porzione centrale della molecola dell’indaco, quindi non i gruppi fenilici laterali, sono responsabili delle sue proprietà cromoforiche.
L’indaco può essere estratto dalle piante del genere Indigofera dopo fermentazione (da parte di Clostridium) delle foglie, dove è presente l’indacano, un β-D-glucoside. Il processo di fermentazione elimina il glucosio e l’ossidazione all’aria converte l’indossile in indaco. La produzione naturale di indaco fu sostituita con quella artificiale nella seconda metà del 19° secolo, dopo che Adolf von Baeyer riuscì per la prima volta a mettere a punto una metodica per la sintesi in laboratorio. La sintesi chimica a livello industriale, tuttavia, richiede l’uso di sostanze altamente tossiche, come anilina, formaldeide e acido cianidrico.
Oggi, grazie alle biotecnologie, si sta tentando di abbandonare la sintesi artificiale e ritornare alla microbiologia, attraverso lo sviluppo di metodi eco-sostenibili basati sui batteri che evitano sia l’impiego di condizioni operative estreme (in termini di pH e di temperatura) sia l’uso di sostanze chimiche pericolose per l’uomo e per l’ambiente, abbattendo i tempi di sintesi, oltre che i costi per lo smaltimento degli scarti. Nell’ambito delle imprese che producono capi in jeans, il recupero della microbiologia sta coinvolgendo tutte le fasi di lavorazione, dalla decolorazione (tramite l’impiego di lieviti modificati che esprimono un enzima perossidasi in grado di rimuovere facilmente il decolorante perossido dai tessuti e dalle acque reflue), alla tessitura (tramite lo sfruttamento di batteri capaci di produrre cotone, come Acetobacter xylinum), alla colorazione, alla produzione di cerniere e materiali da imballaggio dei prodotti finiti (in generale si conoscono più di 25 tipi di batteri, tra cui Ralstonia metallidurans e batteri del genere Rhodococcus e Pseudomonas, che producono poliidrossialcanoati (PHA), polimeri poliesteri simili alle comuni plastiche derivanti dal petrolio, ma totalmente biodegradabili (da altri microrganismi).
Molte specie di Pseudomonas usano una grande varietà di substrati aromatici e poliaromatici come fonte di carbonio e di energia, quali ad esempio naftalene, toluene, xilene e fenolo. Per questo motivo, il batterio Gram-negativo Pseudomonas putida è stato utilizzato per fare “bioremediation” (l’uso dei microrganismi come agenti che rimuovono gli inquinanti), poiché per lui quegli idrocarburi aromatici non sono xenobiotici, lo sono per noi ma non per lui, che è in grado di usarli come fonte di carbonio al posto del glucosio.
Nel 1982, i biochimici Kwang-Mu Yen e Irwin C. Gunsalus iniziarono a fare luce sui geni che rendono Pseudomonas capace di ossidare progressivamente gli idrocarburi aromatici, fino a romperne gli anelli. I ricercatori mapparono i geni per il catabolismo del naftalene (chiamati nah) sui plasmidi, elementi genetici mobili extracromosomiali, circolari e a doppio filamento di DNA. Uno di questi elementi genetici era ed è NAH7, il quale contiene diversi geni che, insieme, consentono a Pseudomonas putida di usare l’idrocarburo naftalene come unica fonte di carbonio e di energia. I geni plasmidici nah sono organizzati in due operoni fiancheggianti: l’operone nal, costituito da sei geni (nominati con le lettere dell’alfabeto da A a F) codificanti per gli enzimi coinvolti nell’iniziale conversione del naftalene a salicilato (naphtalene oxidation), il precursore dell’acido acetilsalicilico, noto principio attivo dell’Aspirina, e l’operone sal, che contiene sette geni (nominati da G a K) che servono per la trasformazione del salicilato in piruvato, il prodotto finale della glicolisi (salicylate oxidation, meta pathway). Il primo prodotto della via di ossidazione del salicilato, il pirocatecolo (un fenolo con un gruppo ossidrile in posizione orto), ottenuto dalla monossigenazione del salicilato, catalizzata da G (enzima salicilato idrossilasi), può anche uscire dalla via catabolica dei geni nah ed essere metabolizzato da enzimi di geni cromosomici a succinil-CoA (un intermedio del ciclo di Krebs) e acetil-CoA (salicylate oxidation, ortho pathway). I due operoni, nal e sal, sono entrambi regolati in trans dal gene nahR, che codifica per l’omonima proteina transattivante, NahR.
Figura: Vie cataboliche del naftalene. Gli enzimi delle vie “Naphthalene oxidation” e “Salicylate oxidation” sono esclusivamente plasmidici. La via “Catechol oxidation” è data da enzimi codificati da geni cromosomici, ma inizia da un intermedio, il pirocatecolo, prodotto da un enzima “plasmidico”. Fonte figura: KM. Yen and I.C. Gunsalus (1985), Journal of Bacteriology, p. 1008-1013, 0021-9193/85/061008-06$02.00/0, proprietà dell’American Society for Microbiology.
Gli enzimi che operano la conversione del naftalene in composti del metabolismo centrale, quali piruvato e acetil-CoA, sono per lo più ossidoreduttasi. Tra questi vi sono monossigenasi e diossigenasi. La reazione che tali enzimi catalizzano consiste nell’utilizzo di uno o due substrati riducenti per la riduzione dei due atomi di una molecola di ossigeno. Nel caso delle diossigenasi, a differenza delle monossigenasi, nel corso di una reazione di ossigenazione entrambi gli atomi (anziché uno soltanto, come accade invece con le monossigenasi) di una molecola di O2 restano legati al substrato principale, in questo caso l’idrocarburo aromatico. Nel caso delle monossigenasi l’altro atomo di ossigeno viene ridotto a formare una molecola d’acqua.
Era il 1983 quando, nel corso della caratterizzazione di frammenti del plasmide NAH7 del ceppo Pseudomonas putida PpG7 clonati in E. coli, Burt D. Ensley e colleghi compresero che era possibile sfruttare la tecnologia del DNA ricombinante per istruire i batteri a produrre il colorante indaco. NAH7 fu prima digerito con l’enzima di restrizione HindIII, poi fu incorporato in pBR322 e quindi clonato in E. coli. pBR322 è un noto plasmide contenente specifici siti di restrizione, un’origine di replicazione rilassata che gli permette di replicarsi autonomamente e due geni (ampR e tetR) che conferiscono alle cellule batteriche che contengono questo plasmide la possibilità di crescere pur in presenza degli antibiotici ampicillina e tetraciclina nel terreno di coltura.
La selezione dei trasformanti venne fatta sulla base della resistenza ad ampicillina, mentre i trasformanti che contenevano l’inserto l’inserto NAH7 venivano individuati grazie al fatto che la resistenza alla tetraciclina veniva persa a causa dell’incorporazione del frammento da clonare all’interno del gene tetR, interrotto in corrispondenza del sito di restrizione di HindIII. Tutti i trasformanti vennero successivamente testati per la loro capacità di sintesi di metaboliti non volatili come risultato del catabolismo del naftalene marcato con l’isotopo carbonio-14, in modo tale da garantire che il plasmide trasformato possedesse i geni per la digestione del naftalene. Subito dopo il clonaggio accadde, del tutto involontariamente, che le colonie e il terreno, che conteneva triptofano, assunsero una tonalità bluastra. Le analisi cromatografiche rivelarono che E. coli stava producendo indaco. Una classica scoperta per serendipità: si lavorava per caratterizzare NAH7, si finì per scoprire il modo di produrre con i batteri un colorante di grande interesse per l’industria tessile.
Cos’era successo dal punto di vista biochimico? E. coli ha un enzima (triptofanasi) che usa il triptofano per produrre indolo, tant’è vero che la produzione di indolo è un carattere identificativo di E. coli. Ma se in E. coli si clonano le ossigenasi che usano come substrato il naftalene (naftalene diossigenasi, enzima A), accade che l’indolo prodotto viene ossidato a cis-indolo-2,3-diidrodiolo. Questo composto perde spontaneamente una molecola di acqua (si forma l’indossile) e la successiva dimerizzazione ossidativa produce il colorante indaco, la cui geometria trans è energeticamente stabile per la presenza di legami a idrogeno intramolecolari. L’isomero geometrico cis è invece destabilizzato a causa della repulsione elettronica tra i dipoli dei gruppi carbonilici e sarebbe questo il motivo per cui non è possibile trovarlo in natura né sintetizzarlo in forma pura.
Figura: Comparazione tra i due isomeri geometrici dell’indaco. Fonte: Chemexplore
Diverse prove sperimentali supportavano l’ipotesi che l’enzima naftalene diossigenasi fosse coinvolto direttamente nell’ossidazione dell’indolo di E. coli:
- Aumentando i passaggi in medium ampicillina-free, i microrganismi ricombinanti perdevano la capacità di ossidare il naftalene e di sintetizzare l’indaco.
- La crescita in terreni arricchiti con triptofano o indolo comportava un considerevole aumento della produzione di indaco.
- Non si osservava formazione di indaco quando E. coli ricombinante veniva fatto crescere in terreni ad elevata concentrazione di glucosio (il glucosio ad alte concentrazioni blocca l’attività della triptofanasi).
- P. putida produceva indaco se nel terreno di coltura veniva aggiunto indolo (P. putida non lo produce da sé)
Figura: Via metabolica attraverso cui E. coli ricombinante produce indaco a partire dal triptofano, utilizzando geni del plasmide NAH7. (Ensley et al., 1983). Fonte: Cornell iGEM
L’espressione della naftalene diossigenasi di Pseudomonas putida, da parte di Escherichia coli (la combinazione delle capacità metaboliche di due organismi in un unico pathway ibrido) ha fatto sì che l’indolo fosse trasformato in indaco. Da quel momento il colorante “indigo blue” è entrato nell’industria fermentativa (dove il termine “fermentativo” non va inteso in senso metabolico, ma riguarda tutto il processo di crescita batterica finalizzato alla produzione di determinati metaboliti e/o di biomassa). Siamo passati quindi da una industria di tipo inquinante ad una ecologicamente sostenibile che fa uso di un microrganismo ricombinante. Una delle strategie più recenti per la sintesi microbica dell’indaco sfrutta la tecnologia degli E. coli ricombinanti e chimicamente immobilizzati ad una matrice solida di cellulosa o gel di silice: da un’estremità del bioreattore fluisce una soluzione contenente triptofano, dall’altra estremità viene recuperato l’indaco prodotto dalle cellule imbrigliate nella matrice.
Bibliografia:
- KM. Yen and I.C. Gunsalus (1982), PNAS, Plasmid gene organization: Naphthalene/salicylate oxidation
- KM. Yen and I.C. Gunsalus (1985), Journal of Bacteriology, Regulation of Naphthalene Catabolic Genes of Plasmid NAH7
- Ri-He Peng (2008), FEMS Microb. Rev., Microbial biodegradation of polyaromatic hydrocarbons
- B. Ensley, B. Ratzkin, T. Osslund, M. Simon, L. Wackett and D. Gibson (1983), Science, Expression of naphthalene oxidation genes in Escherichia coli results in the biosynthesis of indigo
- Robert B. Steel, Several new aspects of indigo chemistry, Chemexplore
- G.J. Tortora, Bardell R. Funke, Christine L. Case, Elementi di Microbiologia, Pearson 2008, p.236